1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。1923年美国菲泽公司建造了世界上家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵法所取代。1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。19Chemicalbook52年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，这一制造技术仍是目前最主要的制造方法。在这个技术中，黑曲霉被放入含有蔗糖或葡萄糖的培养基中进行培养，以生产柠檬酸。糖类的来源包括玉米浆、糖蜜发酵液、玉米粉的水解产物或其他廉价的糖类溶液。在去除霉菌之后，向剩余的溶液中加入氢氧化钙，使柠檬酸反应生成柠檬酸钙沉淀，分离出沉淀之后再加入硫酸就可以得到柠檬酸。