三氯蔗糖的合成路线大体可分为3类：单酯法、化学一酶法和基团迁移法。化学一酶法6位基团保护法该法是Tate-Lyle公司开发的。首先利用芽孢杆菌属的菌株在30℃下发酵葡萄糖，生成葡萄糖-6-乙酸，葡萄糖-6-乙酸的最高浓度可达15g/L，收率可达理论收率的85%。然后采用抽提及硅胶柱层析分离相结合的方法提纯葡萄糖-6-乙酸，提纯收率为80%～85%。在由枯草杆菌产生的β-果糖基转移酶的作用下，葡萄糖-6-乙酸与蔗糖混合反应生成蔗糖-6-乙酸，蔗糖-6-乙酸的浓度可达120g/L，该步收率为58%。采用层析的方法可分离得到7Chemicalbook0%纯度的蔗糖-6-乙酸。蔗糖-6-乙酸与由和DMF制成的Vilsmeier试剂反应，即可得到4，1’，6’，-三氯-4，1’，6’-三脱氧半乳蔗糖五乙酸，该步收率为39%。三氯蔗糖五乙酸脱去乙酸基后即得三氯蔗糖，脱乙酸的收率为90%。该法中葡萄糖-6-乙酸的发酵代价较高，蔗糖-6-乙酸的提纯较困难，总收率约20%。合成路线如下：以棉子糖为原料合成该法也是Tate-Lyle公司开发的。棉子糖甜菜和棉子等植物中，目前尚无大量商品供应，可由半乳糖和蔗糖的饱和溶液在30℃、铲半乳糖苷酶的作用下合成，产物浓度可达7.5g/L。