流动相在1000ml容量瓶中放人35.1g高氯酸钠、1.40g磷酸二氢钾、7.0mL1mol/L氢氧化钾和40ml甲醇，用水定容后，混匀。用1mol/L氢氧化钾调节pH值至7.2(为符合分析系统的要求，甲醇浓度可改变，以适于叶酸的流出时间)。色谱分析系统常用的是在室温下操作的高压液相色谱仪，装有一(25～30)cm×4mm的不锈钢柱，其中充填直径为5～10μm的多孔硅或陶瓷微粒化学键合的十八烷基硅烷。流动相应保持一定的压力和流速，以取得要求的分辨率(见下述系统适用性试验)和适宜的流出时间。使用能在254nm处吸收紫外线的检测器。系统适用Chemicalbook性溶液用每100ml中含2ml氢氧化铵和1g高氯酸钠的水溶液作为溶剂，配制每ml各含1mg药典级参比标准叶酸和药典级甲酰四氢叶酸钙的溶液。使用前通过一孔隙度≤1μm，的膜滤器过滤溶液。系统适用性试验用色谱仪分离相同体积(可达25μl)的标准液的5个进样，并按检测步骤测定峰响应值。按公式100×(标准偏差/平均峰响应值)计算峰响应值的相对标准偏差，不得超过2%。用相同方式注射25μ1体积的系统适用性溶液。按色谱仪通用试验用于R的公式计算甲酰四氢叶酸钙和叶酸之间的分辨率系数，不得小于3.6(用特殊的柱时，减少流动相中的甲醇量可提高分辨率)。